BAHAN DAN CARA KERJA

AntigenLarva — 3 (L3) : Nyamuk digigitkan pada gerbil yang mengandung mikrofilarja B. malayi. Setelah beberapa hari, L3 dapat ditemukan pada nyamuk, dipisahkan dan disimpan dalam media RPMI 1640 pada -20°C.

Cacing dewasa : Didapat dari gerbil yang terinfeksi dengan B. malayi. Setelah dikeluarkan dari gerbil, disimpan dalam RPMI 1640 pada suhu -20°C.

L3 maupun cacing dewasa B. malayi diekstraksi dengan cara sonikasi. Kadar protein antigen diukur dengan cara Biorad. Imunisasi L3 atau cacing dewasa dengan jumlah protein 20–100 ug/ml disuntikkan pada inbred alb/c usia 4–6 minggu. Imunisasi dilakukan 4 kali : 3 kali secara intraperitoneal dengan selang resep mie waktu 1 minggu dan intra vena dilaksanakan dalam jangkawaktu 1 minggu setelah penyuntikan intraperitoneal terakhir.Sel mieloma

Sel mieloma dari Balb/c (SP–2) dibiakkan dalam mediaDMEM selama kurang lebih 2 minggu sebelum dipakai untuk fusi dengan sel limfosit dari limpa.

Sel limfosit 3 hari setelah imunisasi intravena, limpa Balb/c dikeluarkan

secara steril, dibersihkan dan dipecah-pecah sehingga sel liln- fosit lepas ke dalam media pencuci. Fusi

Sel mieloma dan sel limfosit dicuci 3 kali dengan DMEM; kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1000 rpm. Fusi dilakukan dengan menggunakan polietilengli- kol (PEG) dengan perbandingan jumlah sel mieloma dan sellimfosit 1: 1. Sel hibrid dibiakkan dalam culture plate dengan resep ayam jumlah se13 x 10 6/ml dalam inkubator CO2. ELISA4 ug/ml L3 dipakai sebagai antigen pada ELISA untuk deteksi antibodi spesifik dalam serum Balb/c dan supernatansel hibrid. Sera diencerkan 1 : 100 sedangkan supernatan 1 : 1. Goat anti mouse conjugate diencerkan dengan pengenceran 1: 1000. Kloning

Sumur biakan sel hibrid yang pada tes supernatan menunjuk kan tes ELISA positip sebanyak 2x, diteruskan pemeliharaan menjadi biakan monoklon dengan menggunakan cara limiting dilution sebanyak 2x. Selanjutnya biakan monoklon tersebut resep ikan dipelihara di dalam culture

flask untuk produksi antibodi monoklonal.Telah dilakukan imunisasi 40 tikus Balb/c dengan dosis 20- 100 ug/ml dengan cara ip/subkutan dan intra vena (lihat tabel

2). Selanjutnya dilakukan fusi 32 tikus karena 6 tikus mati dan2 tikus hilang. Sel hibrid dites dengan ELISA paling sedikit2x. Sel hibrid yang menunjukkan reaksi antibodi spesifikdilakukan kloning dengan cara limiting dilution.

HASIL ELISA

Tes ini digunakan untuk deteksi antibodi pada Balb/c selama dan setelah imunisasi serta untuk deteksi antibodi pada su- pernatan biakan sel hibrid. Konsentrasi antigen L3 yang di- pakai adalah 4 ug/ml denganpengenceran sera 1 : resep masakan padang 100 dan conjugate 1 : 1000. Supernatan sel hibrid dites dalam keadaan tidak diencerkan. Nilai ELISA ditentukan dengan extinction value melalui bacaan dengan ELISA reader. Standardisasi baca- an dilakukan dengan menentukan angka 0,800 untuk IgGpositip sera Balb/c. Sel hibrid yang menentukan harga ELISA 0,200 atau lebih diteruskan untuk kloning.Imunisasi

Dari berbagai jadual imunisasi dan route penyuntikan yang di-laksanakan, diperoleh reaksi antibodi (IgG) terhadap L3 yangterbaik didapatkan pada cara intraperitoneal sebanyak 2x (selang satu minggu antara 2 suntikan), disusul suntikan intra vena 1 minggu setelah suntikan intraperitoneal terakhir. Hasil yang dicapai ini resep donat

diperoleh dengan menggunakan dosis 20, 50 atau 100 ug per suntikan baik untuk L3 maupun cacing dewasa (CD). Penyuntikan intraperitoneal pertama dilakukan

dengan menggunakan Complete Freund Adjuvant (CFA) disusul campuran dengan Incomplete Freund Adjuvant (IFA) pada intraperitoneal kedua dan ketiga (Tabel 1).

Tabel 1. IgG respons terhadap L3 (ELISA) pada imunisasi dengan L3 atau cuing ewasa B.malayi. Antigen I(ip)

I (sc/ip) II Op)III

Op)IV (iv)

ELISA)

(IgG) L3

20 — lowongan bumn

20 20 20 0,822

L3 50

— 50 50 50

0,790 L3

100 –100 100 100

0,800 L3

100–

100 50 200,497

L3–

100 100 50 50 lowongan kerja

0,688 L3

— 100

100 20 20 0,395

Cacing 100

— 100 50 20

0,539 DewasaCacing

50 —

50 20 200,257

Dewasabackground image

46Tabel 2. Persentase sumur biakan yang menghasilkan sel hibrida dan

sel hibrida yang menunjukkan reaksi terhadap ekstrak L3 dan cacing dewasa lowongan kerja agustus B.malayi pada ELISA. Seri # sumur # sumur %sumur %

% Cloning I

II biakan sel

hibrid sel

hibrid Elisa Elisa

#=% Ketr.1 864 128 14.8 5

3.9 2=0.41% 11=3.3%

mati2 576 9

1.6 ­­

­­

mati 3 864 118 13.6 12 lowongan kerja april

10.1 – ­ mati

4 432 127 29.4 ­ ­

­ ­

mati 5 300 94 31.3 ­

­ ­

­ mati6 234 24 10.2 ­

­ ­

­mati

7 312 53 16.9 ­­

­­

mati 8 235 48 24.4 6 lowongan kerja cpns

12.5 1=0.16 ­

mati 9 233 8

3.4 ­ ­

­ ­

mati 10 134 1

0.7 ­ ­­

­ mati

11 233 10.4 1

100 1=0.34­

mati12 154 ‘­ lowongan kerja desember

­ ­

­ ­

­ mati

13 384 11 2.9 ­

­ ­

­ mati

14 453 7 1.5 ­­

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s


%d bloggers like this: